Στη νότια πλευρά του μεγάλου ναού, βρίσκεται το αρχαίο Βαπτιστήριο του 4ου αι., το αρχαιότερο και καλύτερα διατηρημένο βαπτιστήριο σ'όλη την ορθόδοξη Ανατολή, γι'αυτό και αποτελεί το σπουδαιότερο από τα προσκτίσματα της Εκατονταπυλιανής.
Είναι μια τρίκλιτη βασιλική διαστάσεων 16,5Χ15 μέτρων, με τρούλλο και νάρθηκα, η οποία επικοινωνεί με τον κυρίως ναό και της οποίας το καθένα κλίτος είχε μετατραπεί σε παρεκκλήσιο, στους μεταγενέστερους χρόνους. Οι θόλοι και ο τρούλλος είναι κατασκευασμένοι με χρωματιστούς πωρόλιθους, όπως ο μεγάλος ναός και το παρεκκλήσιο του Αγίου Νικολάου. Στον χώρο του Αγίου Βήματος, που λεγόταν τότε "Εσώτερος οίκος ή Φωτιστήριον", υπάρχει η μαρμάρινη σταυρική κολυμβήθρα, της οποίας το μεγαλύτερο μέρος βρίσκεται μέσα στη γη. Στο τμήμα της που εξέχει από το έδαφος, υπάρχουν ανάγλυφοι σταυροί μέσα σε κύκλους.
Ο κατηχούμενος που προσερχόταν στο βάπτισμα, περνούσε πρώτα από τον νάρθηκα του βαπτιστηρίου, που λεγόταν "Εξώτερος ή προαύλιος οίκος". Εκεί γινόταν η προετοιμασία του μυστηρίου, με τους εξορκισμούς, την παραδοχή της νέας πίστης, την απαγγελία του συμβόλου της κ.λπ. Στη συνέχεια προχωρούσε προς το Φωτιστήριο. Κατέβαινε στην κολυμβήθρα από τη μικρή σκάλα που βρίσκεται στη δυτική κεραία του σταυρού, η οποία συμβόλιζε την προέλευσή του από τον κόσμο της αμαρτίας και μετά το μυστήριο ανέβαινε από την σκάλα της ανατολικής κεραίας, η οποία συμβόλιζε την είσοδο του νεοφώτιστου στην αληθινή ζωή του Χριστιανού.
Ο ιερέας που τελούσε το μυστήριο στεκόταν πάνω σε βάθρο, που βρισκόταν στο μέσον της κολυμβήθρας και λεγόταν "Ιερά Νησίδα". Μετά το βάπτισμα επακολουθούσε το χρίσμα, η ένδυση του νεοφώτιστου με ρούχα λευκά, η είσοδός του στον κυρίως ναό και η Θεία Κοινωνία. Την θέση της ιερής νησίδας, στο βαπτιστήριο της Εκατονταπυλιανής, κατέχει σήμερα μια μικρή κολώνα που τοποθετήθηκε εκεί μεταγενέστερα.
Όλα αυτά συνέβαιναν τους πρώτους χριστιανικούς αιώνες και μέχρι την εποχή του αυτοκράτορα Ιουστινιανού, κατά την οποία άρχιζε να επικρατεί ο νηπιοβαπτισμός. Μέχρι τότε οι άνθρωποι βαπτίζονταν σε μεγάλη ηλικία, αφού περνούσαν το στάδιο της κατήχησης και οι κατηχητές τους πείθονταν ότι μπορούσαν να γίνουν πιστοί. Γι'αυτό, η ύπαρξη βαπτιστηρίου σ'αυτό το σημείο αποτελεί ακόμα μια απόδειξη με την οποία επαληθεύεται η παράδοση ότι ο ναός αυτός πρωτοκτίστηκε τον 4ο αι.
Στο δάπεδο του βαπτιστηρίου της Εκατονταπυλιανής σώζονται τμήματα από το παλιό μωσαϊκό δάπεδο, που αρχικά είχε αυτός ο ιερός χώρος και που, όπως φαίνεται, ήταν πολύ καλής τέχνης.
Στο βαπτιστήριο υπάρχει πολύ φθαρμένη όμως, η αρχαιότερη τοιχογραφία απ\'όσες βρέθηκαν σ'όλο το νησί, η οποία εικονίζει αδιευκρίνιστο άγιο. Η κατασκευή της τοποθετείται στον 11ο ή τον 12ο αι.